E-Silk: электропроводящий шелк паука

Пау Анта-Клуселла,pauanta@icloud.com 

https://www.pauanta.bio/e-шелк 

https://github.com/PauAntaBio/spider-silk-hardware 

Вашингтон, округ Колумбия.

Проект: август 2022 г.

Введение

Шелк паука представляет собой биоматериал с превосходными физическими свойствами, такими как высокая прочность на растяжение, высокая эластичность и высокая ударная вязкость [1, 5, 7]. Из-за свирепого характера пауков текущий метод производства паучьего шелка включает получение рекомбинантных спидроинов в бактериальных системах и прядение их в шелк [2, 3, 8]. Однако использование денатурации при очистке и волокнообразовании спидроинов приводит к получению шелка пауков с неудовлетворительными механическими свойствами [5].

В нем представлено новое применение синтетического паучьего шелка: паутинного шелка с электропроводностью, который можно использовать в одежде для создания цепей или расширения существующих областей применения умных тканей. Некоторые примеры включают в себя: датчики растяжения, функциональные кнопки и схемы, которые могут активировать небольшое устройство.

С помощью методов генной инженерии был создан и экспрессирован рекомбинантный белок паучьего шелка.кишечная палочка. Этот спидроин состоит из N-конца из шелка большой ампулы (MaSP) с повторяющейся областью и С-конца из шелка малой ампулы (MiSP). Далее, добавляя мотив тетрацистеина, спидроин должен приобретать способность связываться с наночастицами золота (Au) через дисульфидные связи [4]. Золото было выбрано из-за его устойчивости к окислению и электропроводности.

1

Дизайн пользовательского белка

Спидроины различаются по длине и размеру, но обычно состоят из трех частей: неповторяющегося глобулярного N-конца (NT), обширной повторяющейся области, богатой глицином и аланином, и неповторяющегося глобулярного C-конца (CT) [3]. Субъединицы NT представляют собой пучки из 5 альфа-спиралей; при уровне рН выше 7 они мономерны, но димеризуются при уровне рН ниже 6. Процесс димеризации состоит в смещении альфа-спиралей с образованием плоской поверхности димера, что позволяет антипараллельным субъединицам объединяться [5]. CT является стабильным и растворимым гомодимером при уровне pH выше 6,5, но при снижении pH ниже 5,5 он дестабилизируется и теряет свою спиральную структуру, вместо этого образуя фибриллы β-листа. Повышенное pCO2 (парциальное давление CO2) также помогает разворачиваться, взаимодействуя с частично скрытыми остатками в CT [5]. Переход CT в фибриллы β-листа приводит к образованию ядер, которые могут индуцировать трансформацию повторяющейся области в полимеры β-слоя [5].

Пользовательский белок был в значительной степени основан на синтетическом паучьем шелке, разработанном командой Great Bay iGem в 2019 году [3]. Домен NT пользовательского spidroin принадлежитЮпростенопс австралийскийMaSp (рис. 1) из-за его высокой растворимости и чувствительности к pH [3, 8], в то время как повторяющаяся область и домен CT изАранеус желудочковыйMiSp. Поскольку повторяющаяся область очень богата аланином и глицином, настолько, что эпителиальные клетки паукообразных желез имеют аномально большие пулы тРНК для двух аминокислот [5], спидроин содержал только 2 повторяющихся области. В противном случаекишечная палочкаможет быть не в состоянии экспрессировать большое количество белков. Линкер GNS соединял различные области вместе, в то время как метка 6His использовалась для очистки Ni-NTA. Мотив тетрацистеина (TC) был добавлен к повторяющейся области, чтобы позволить спидроину связываться с наночастицами Au.

2

Рисунок 1. Изображение N-концевого домена рекомбинантного спидроина. Красным цветом обозначен линкер GNS, зеленым цветом — гомодимер NTD, желтым цветом — сайт расщепления протеазой фактора Ха (никогда не применялся), а фиолетовым цветом — метка 6His.

Мотив TC — это кодируемый мотив, изначально разработанный дляжитьвизуализация белков. Он состоит из 2 цистеинов, за которыми следуют 2 нецистеиновых остатка, за которыми следуют еще 2 цистеина (Cys - Cys - X1- ИКС2- Cys - Cys) [4, 6]. Тиолы цистеинов предназначены для связывания с двумышьяковыми красителями, которые затем флуоресцируют, но мотив TC также может быть способен связываться с поверхностными молекулами наночастиц Au через дисульфидные связи. Более того, за счет превращения двух средних аминокислот в пролин и глицин соответственно мотив TC образует структуру бета-шпильки, которая контролирует ориентацию наночастиц Au [4, 6].

3

Последовательность ДНК и экспрессия

Следующая последовательность (рис. 2) кодирует вышеупомянутый спидроин с доменом NT изЮпростенопс австралийскийMaSp, повторяющаяся область и домен CT происходят изАранеус желудочковыйMiSp, мотив TC, тег 6His и линкеры GNS. Плазмида ДНК была заказана у Atum (Вwww.atum.bio) вкишечная палочкавектор экспрессии с IPTG

индуцируемый промотор Т5 и устойчивость к хлорамфениколу.

Рисунок 2. Последовательность ДНК специального белка шелка паука.

4

Из-за стоимости синтеза ДНК было невозможно заказать две отдельные плазмиды, одну с мотивом TC, а другую без него, для сравнения свойств обычного синтетического шелка паука и электропроводящего шелка паука. Вместо этого сайт разреза NgoMIV и BsaI (выделенный оранжевым и зеленым соответственно) был введен с обеих сторон мотива TC, чтобы удалить его с помощью двойного расщепления.

Наночастицы

Причина использования наночастиц Au заключается в том, что золото сопротивляется окислению и очень хорошо проводит электричество, и, связывая его со спидроинами, они теоретически должны приобретать электропроводность. Образец 120 мл дисперсии наночастиц Au в воде с концентрацией 100 ppm был заказан в US Research Nanomaterials, Inc.https://www.us-nano.com). Au

наночастицы были получены с использованием золота чистотой 99,99% в качестве сырья и имели диаметр 14 нм. Их хранили при комнатной температуре в темных условиях и обрабатывали ультразвуком перед каждым использованием, чтобы предотвратить любую агрегацию наночастиц.

Микрошприцевой насос и захватный ролик

Существует множество методов прядения паучьего шелка, самый простой из которых — мокрое прядение, при котором спидроины растворяют в химическом растворе перед поступлением в коагуляционную ванну, удаляющую растворитель и вызывающую конформационные изменения [5, 7]. Существует множество комбинаций растворителей и коагуляционных ванн, таких как концентрированный водный раствор в насыщенном растворе аммония, гексафторизопропанол в метаноле, гидрат гексафторацетона в метаноле и муравьиная кислота в метаноле [7].

Для выполнения мокрого прядения с нуля был создан микрошприцевой насос на основе конструкции с открытым исходным кодом, найденной на GitHub [10]. При сохранении той же спецификации микрошприцевой насос был приспособлен для вертикального выдавливания спидроинов.(Рисунок 3А)в акриловый футляр, в котором находилась ванна для коагуляции (рис. 3В). Ролик захвата после вращения (рис. 3C) был добавлен для сбора шелка паука по мере его коагуляции. Кодирование было сделано полностью с нуля в Arduino IDE с цельюспособность выдавливать допинг со скоростью до 1 мкл/мин. Некоторые детали были разработаны по индивидуальному заказу и выполнены в 3D.

5

печатных, таких как корпус, в котором находились двигатели, кнопки и моторный щит Arduino. Благодаря конструкции микрошприцевого насоса сила сдвига способствует процессу коагуляции спидроинов [5, 7, 8].

А

С

Б

Рис. 3. Микрошприцевой насос: A) Шаговый двигатель, толкающий шприц с желаемой скоростью потока; B) Коагуляционная ванна, в которую будут помещены спидроины. Он будет заполнен химическим веществом, таким как изопропанол; и C) Ролик пост-вращения, который будет собирать шелк паука после его коагуляции.

6

Эксперимент

Плазмида ДНК поступала в фильтровальную бумагу и экстрагировалась путем инкубации ее при комнатной температуре с водой в течение 2 минут и центрифугирования на максимальной скорости в течение 10 минут. Когда вода текла через фильтровальную бумагу, она собирала ДНК на дне центрифужной пробирки. Фильтровальную бумагу выбрасывали, а часть ДНК использовали для трансформации клеток E.coli в твердую культуру. Клетки росли в течение ночи и использовались в минипрепарате для амплификации количества плазмид ДНК, доступных для экспериментов. Концентрацию амплифицированных плазмид определяли с помощью спектрофотометра, а затем использовали для двойного расщепления ДНК и лигирования с NgoMIV и BsaI для создания образца ДНК без мотива TC.

Если бы ДНК была лигирована должным образом, сайт разреза NgoMIV должен был быть удален, а сайт разреза BsaI сохранился. Чтобы проверить, правильно ли был удален мотив TC, проводили отдельные гидролизы ДНК с лигированной ДНК и BsaI и NgoMIV. Затем образцы разделяли с помощью гель-электрофореза (рис. 4). Поскольку плазмиды ДНК после расщепления перемещаются медленнее, ожидаемые результаты успешного удаления мотива ТС должны были бы состоять в том, что полоса 4А перемещается дальше всего, полоса 4В перемещается на такое же расстояние, а полосы 4С и 4D перемещаются на заметно меньшее расстояние, чем полоса 4В. другие. Вместо этого было замечено, что полоса 4A перемещается дальше всего, в то время как полосы 4B, 4C и 4D перемещаются примерно на такое же расстояние (рис. 4). Отсюда можно сделать вывод, что мотив ТС не был должным образом удален из плазмид ДНК. Из-за нехватки времени я не смог повторить дайджест и попытаться получить плазмиды без мотива ТС.

7

Рисунок 4. Гель-электрофорез лигированной и нерасщепленной ДНК с NgoMIV и BsaI. Слева направо образцы представляют собой лестницу и 20 мкл исходной нерасщепленной ДНК с мотивом TC, лигированной ДНК из двойного перевара с помощью NgoMIV, лигированной ДНК из двойного перевара с BsaI и исходной нерасщепленной ДНК. с БСАИ.

кишечная палочкаклетки трансформировали амплифицированными ДНК-плазмидами и выращивали в твердой культуре в течение ночи. Затем их индуцировали с помощью IPTG и оставляли еще на один день для продукции спидроинов, после чего их собирали и лизировали. Часть цельноклеточного лизата сохраняли, а другую часть очищали с помощью очистки никель-NTA. Однако результаты анализа белков с помощью масс-спектроскопии оказались совершенно неожиданными и позволили предположить, что белки могли быть очищены неправильно.

1 мл образцов цельноклеточного лизата и очищенных белков помещали в шприцы 27 G и 30 G с иглами разного диаметра и экструдировали с разной скоростью в коагуляционную ванну с изопропанолом. В конечном итоге из цельного клеточного лизата в шприце 27 G с диаметром наконечника 0,21 мм при скорости экструзии 15 мкл/мин был получен шелк паука (рис. 5). Возможно, что очищенные белки не ускользали должным образом или были разбавлены настолько, что они не могли должным образом образовывать нити паучьего шелка.

8

Рисунок 5. Шелк паука, полученный из лизата цельных клеток в ванне для коагуляции изопропанола.

Прежде чем связывать наночастицы золота с белками шелка паука, наночастицы золота обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут, чтобы отменить любую агрегацию. В боковой части шприца было просверлено небольшое отверстие, куда была помещена трубка, соединяющая его с баллоном с азотом. Из-за успеха лизата в производстве шелка паука образец лизата объемом 3 мл смешивали в шприце с 1 мл раствора наночастиц Au и через отверстие в шприце вводили газообразный азот. Был добавлен газообразный азот, так как он химически инертен, и при удалении кислорода из шприца наночастицы Au должны были меньше окисляться и быть более способными связываться с белками. Однако раствор белка и наночастиц золота не смог произвести нити паучьего шелка, и из-за нехватки времени я не смог продолжить изучение этого вопроса.

9

Двигаться вперед

Чрезвычайно важно правильно очистить белки и получить их в высокой концентрации. Это должно решить первоначальную проблему, связанную с тем, что очищенные белки не производят никакого шелка по сравнению с листатом. Кроме того, необходимо будет провести дополнительные исследования, чтобы найти оптимальное соотношение наночастиц Au и белков и определить, должны ли наночастицы Au быть другого размера. Еще кое-что, что следует учитывать, - это следует ли изменить дизайн белка, чтобы иметь несколько мотивов TC, или мотив TC должен быть включен вообще. Другими вариантами, помогающими белкам связываться с наночастицами золота, могут быть замена определенных остатков цистеинами или включение длинных последовательностей только с цистеинами. Принимая во внимание эти и другие соображения, я с оптимизмом смотрю на этот проект в будущем и на производство синтетического паучьего шелка, который проводит электричество!

10

Рекомендации

1.Vienneau-Hathaway, J.M., Brassfield, E.R., Lane, A.K. и другие. Дублирование и согласованная эволюция генов, кодирующих MiSp, лежат в основе свойств материала малой ампулы шелка пауков, плетущих паутину. BMC Evol Biol 17, 78 (2017).https://doi.org/10.1186/s12862-017-0927-x.

2.Дептуч, Т., и Дамс-Козловска, Х. (2017). Шелковые материалы, функционализированные с помощью генной инженерии для биомедицинских приложений. Материалы, 10(12), 1417.https://doi.org/10.3390/ma10121417.

3.Ли, К., Лю, Дж., и Ян, Дж. (nd). Spidroin Engineering с хромопротеином и натуральным красителем.https://2019.igem.org/Команда:GreatBay_SZ.

4.Рид, AMW (nd). Генетически кодируемая ориентированная адсорбция белков на наночастицах золота [Докторская диссертация]. Цифровой Джорджтаун.https://repository.library.georgetown.edu/handle/10822/557940.

5.Райзинг А., Йоханссон Дж. К прядению искусственного паучьего шелка. Nat Chem Biol 11, 309–315 (2015).https://doi.org/10.1038/nchembio.1789.

6.Ленгмюр 2010, 26, 24, 18945–18950 Дата публикации: 29 ноября 2010 г.https://doi.org/10.1021/la1035135.

7.Мадурга, Р., Ганьян-Кальво, А.М., Плаза, Г.Р., Гвинея, Г.В., Элисес, М., и Перес-Ригейро, Дж. (2017). Производство высокоэффективного биошелка

Волокна путем напрягающего проточного прядения. Биомакромолекулы, 18(4), 1127-1133.https://doi.org/10.1021/acs.biomac.6b01757.

8.Андерссон, М., Цзя, К., Абелла, А., Ли, X.-Y., Ландре, М., Пурхонен, П., Хеберт, Х., Тендже, М., Робинсон, К.В., Мэн, К. ., Плаза, Г. Р., Йоханссон, Дж., И Райзинг, А. (2017). Биомиметическое прядение искусственного паучьего шелка из химерного миниспидроина. Nature Chemical Biology, 13(3), 262-264.https://doi.org/10.1038/nchembio.2269.

9.Лав, Дж. К., Эстрофф, Л. А., Крибель, Дж. К., Нуццо, Р. Г., и Уайтсайдс, Г. М. (2005). Самособирающиеся монослои тиолатов на металлах как форма нанотехнологии. Химические обзоры, 105(4), 1103-1170.https://doi.org/10.1021/cr0300789 

10.Тео Уокер. 2014. Открытый шприцевой насос.

https://github.com/manimino/OpenSyringePump.

11